Allestimento di colture cellulari in specie “a rischio”

Al fine di indagare la diversa sensibilità interspecifica ai composti inquinanti, è stata messa a punto un’innovativa metodologia per la coltura di fibroblasti di specie “a rischio” marine, in particolare di cetacei, ma anche di pinnipedi, tartarughe marine, pesci pelagici, a partire dall’epidermide ottenuta tramite biopsia cutanea. Questa può essere ottenuta utilizzando tre diversi metodi di campionamento: dardo sparato da fucile a CO₂ compressa; dardo sparato con balestra; palo da biopsia. In tutti i casi la punta della freccia è modificata in modo tale da trattenere al suo interno una piccola parte (10 mm x 5 mm) di tessuto cutaneo ed adipe sottocutaneo. Per l’allestimento delle colture cellulari, una parte di epidermide e tessuto adiposo vengono stoccati in una provetta sterile contenente il mezzo di coltura. Entro 48 h dal prelievo, il campione deve essere trasportato a temperatura ambiente in laboratorio, dove viene lavato, triturato e tripsinizzato prima di essere incubato nel terreno di coltura completo a 37°C. I primi fibroblasti compaiono in un periodo compreso tra 7 e 21 giorni, raggiungendo il 90% di confluenza in 15-20 giorni dopodichè, mediante tripsinizzazione, vengono passati in fiasche sempre più grandi, fino al raggiungimento della confluenza nella fiasca da 150 ml. Il tempo necessario per raggiungere tale stato, ma anche massimo per avere una crescita continua, è di 4 mesi. Passato questo lasso di tempo, si notano segni evidenti di senescenza e di resistenza alla tripsinizzazione. La contaminazione da microorganismi si è dimostrata una delle maggiori cause della limitata vitalità o della lenta crescita delle cellule. La rapida proliferazione di batteri, ma soprattutto di funghi produce un ambiente sfavorevole per la crescita dei fibroblasti, sia per la deplezione delle sostanze nutrienti che per il cambiamento di pH. E’ stato dimostrato che in tutti i casi si tratta di infezioni latenti del campione che si sviluppano nel periodo di  incubazione. L’infezione più persistente infatti, risulta essere una candida di origine ambientale. Sulle linee continue di cellule, ottenute da esemplari di specie di cetacei, vengono effettuati diversi test di tossicità in vitro, per valutare le risposte delle monoossigenasi a funzione mista (MFO) e i danni sul DNA in funzione della dose dei vari contaminanti di trattamento. In questo modo è stato inoltre possibile dare un’ulteriore conferma ai risultati ottenuti in vivo da esemplari liberi nel loro ambiente naturale.
Ultimamente linee di fibroblasti di cetacei sono state utilizzate per mettere a punto un nuovo biomarker non distruttivo, rappresentato dall’attività della proteina MIC-A, per valutare lo stato immunitario delle diverse specie di cetacei. Infatti, all'interno del complesso MHC (Major Histocompatibility Complex) viene codificata la proteina MIC-A, espressa principalmente sulla superficie cellulare dell'epitelio; la sua precisa funzione non è attualmente conosciuta, ma la sua espressione nell’uomo è spesso associata alla comparsa di processi infiammatori o tumori di origine epiteliale, ad alcuni melanomi, a patologie come la celiachia,  al morbo di Crohn e al rigetto dei trapianti. Nostro scopo è validare la proteina MIC-A come target di immunodepressione per i cetacei, utilizzando la biopsia cutanea come metodo non invasivo di campionamento. Questo studio rappresenta un importante step per la valutazione dello stato di salute di questi Mammiferi. L’attività del MIC-A viene valutata attraverso l'immunofluorescenza indiretta su colture di fibroblasti.
Oltre ad utilizzare la biopsia cutanea in esemplari free-ranging per l’allestimento delle colture cellulari di fibroblasti, vengono ottenute linee cellulari di fibroblasti e di epatociti da esemplari spiaggiatisi da un tempo massimo di 24 h (cetacei, pinnipedi o tartarughe) o rimasti nelle reti (pesci pelagici o cetacei) od ospedalizzati (tartarughe).